綠色熒光蛋白GFP的應(yīng)用

1 綠色熒光蛋白GFP在分子生物學(xué)上的應(yīng)用

1.1 綠色熒光蛋白GFP作為報告基因 

報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的DNA，如傳統(tǒng)的熒光素酶（LUX）基因和β-葡萄糖苷酶（GUS）基因。綠色熒光蛋白GFP作為基因報告可用來檢測轉(zhuǎn)基因效率，把綠色熒光蛋白GFP基因連接到目的基因的啟動子之后，通過測定GFP的熒光強(qiáng)度就可以對該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。目前，此方法無論在農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中還是在活細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因胚胎和動物中都已得到非常廣泛的應(yīng)用，特別是在活細(xì)胞基因表達(dá)的時空成像方面。

 1.2 綠色熒光蛋白GFP作為融合標(biāo)簽

綠色熒光蛋白GFP*成功的一類應(yīng)用就是把綠色熒光蛋白GFP作為標(biāo)簽融合到主體蛋白中來檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用，或者靶向標(biāo)記某些細(xì)胞器。在多數(shù)情況下，綠色熒光蛋白GFP基因在N-或C-末端與異源基因用常規(guī)的分子生物學(xué)手段就可以接合構(gòu)成編碼融合蛋白的嵌合基因，其表達(dá)產(chǎn)物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現(xiàn)出與天然GFP相似的熒光特性。GFP的這種特性為蛋白質(zhì)提供了一種熒光標(biāo)記，不僅可以檢測蛋白質(zhì)分子的定位、遷移，還可以研究蛋白質(zhì)分子的相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，并依靠熒光共振能量轉(zhuǎn)移即FRET來進(jìn)行檢測。

2 作為生物傳感器

 2.1  檢測pH 

野生型GFP和其許多突變體都具有依賴于pH的熒光變化，因而可以被用來檢測活細(xì)胞內(nèi)的pH。人們通常稱它們?yōu)镻hluprin。分為兩類：比率Phluorin和盈缺Phluorin。當(dāng)pH降低時，比率Phluorin的*大激發(fā)波長從395nm到475nm遷移，利用兩個***長處的熒光強(qiáng)度的比率可以測量pH；當(dāng)pH值小于6時，盈缺Phluorin在475nm處沒有熒光。當(dāng)pH回復(fù)到中性時，兩類Phluorin都會在20ms內(nèi)復(fù)原。

2.2  檢測鹵素離子 

YFP（H148Q）變體不但對pH敏感而且對不同離子也同樣敏感，故可以用來檢測亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鹵素離子的濃度和傳遞

2.3  其他檢測應(yīng)用 

另外，GFP可以應(yīng)用于檢測電位、氧化還原水平以及在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中作為Ca2+指示劑

3 綠色熒光蛋白GFP在細(xì)胞生物學(xué)上的應(yīng)用

綠色熒光蛋白GFP具有同宿主蛋白構(gòu)成融合子的性質(zhì)，利用這一性質(zhì)，可以將GFP定位到特定的細(xì)胞器和膜系統(tǒng)中，進(jìn)行細(xì)胞生理過程、細(xì)胞動力學(xué)等的實(shí)時觀測，或直接應(yīng)用于定量分析。目前，GFP已經(jīng)被成功地用于靶向標(biāo)記包括細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等在內(nèi)的細(xì)胞器。用GFP進(jìn)行亞細(xì)胞定位，避免了提純蛋白、標(biāo)記異硫氰酸熒光素等熒光染料、經(jīng)顯微注射或其他方式導(dǎo)入細(xì)胞的復(fù)雜方法，從而使研究蛋白在活細(xì)胞的準(zhǔn)確定位變得簡單易行。

 4  綠色熒光蛋白GFP在篩選方面的應(yīng)用

 4.1 綠色熒光蛋白GFP用于細(xì)胞的篩選 

基于GFP的熒光特性，并且熒光穩(wěn)定以及檢測方法快速、方便，GFP在細(xì)胞篩選上得到應(yīng)用廣泛。 

4.2  綠色熒光蛋白GFP用于**的篩選 

利用GFP對目的物進(jìn)行標(biāo)記，追蹤GFP，分析目的物在細(xì)胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似的化合物