顯微鏡相關(guān)知識

用于顯微注射用的顯微鏡常使用具有相差(phasecontrast) 與微分干涉(differential interference contrast) 功能的倒置顯微鏡( 例如奧林巴斯的倒置顯微鏡IX 系列) 。

倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，一般正置顯微鏡的物鏡在載物臺之上，照明系統(tǒng)在下，而倒立式顯微鏡為物鏡在下，照明系統(tǒng)在載物臺之上。倒置顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)為物鏡與目鏡間的工作距離較長，可直接將培養(yǎng)皿置于顯微鏡操作臺上進(jìn)行顯微注射等工作。

傳統(tǒng)的普通光學(xué)顯微鏡無法直接觀察未經(jīng)染色的透明活細(xì)胞，為了能讓顯微注射技術(shù)觀察與操作透明的活細(xì)胞樣品，顯微鏡必須使用具有相差與微分干涉功能的倒置顯微鏡。

相差顯微鏡是由P.Zernike 于1932 年發(fā)明的，并因此獲得1953 年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡*大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的透明標(biāo)本和活細(xì)胞。相差顯微鏡的基本原理是利用透明細(xì)胞檢體內(nèi)部折射率的各不相同，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，得到明暗對比的效果，使得透明活細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)節(jié)在亮背景視野中變得清晰可見。

相差顯微鏡的基本構(gòu)造是利用相差聚光鏡及內(nèi)部相環(huán)所構(gòu)成的環(huán)狀光圈，當(dāng)光通過聚光鏡后，產(chǎn)生中空光錐，并在光線穿過檢體后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了 1/4λ （波長），如果再經(jīng)過物鏡內(nèi)的光延遲位環(huán)板而成增加或減少1/4λ ，則光程差變?yōu)?/span>1/2λ ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減小提高反差。

雖然相差顯微鏡可以為透明的細(xì)胞樣品提供清晰的觀察圖像，但是一般相差顯微鏡的缺點(diǎn)是會有“光暈”現(xiàn)象產(chǎn)生。因而導(dǎo)致觀察的景深受限制，無法用來觀察較厚的樣品。較厚的細(xì)胞團(tuán)區(qū)域在一般相差顯微鏡下的清晰度十分糟糕，而且邊緣常產(chǎn)生暈輪效果，如果觀察樣品中有超過 85% 以上的區(qū)域?yàn)檩^厚細(xì)胞時(shí)，這個問題將非常嚴(yán)重。然而顯微注射的樣品如受精卵細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)均具有一定厚度，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和邊緣無法清楚可見，因此顯微注射用的顯微鏡必須要能克服厚樣品的問題。

為解決活動樣品和厚樣品帶有“光暈”的觀察問題，1952 年，Nomarski 在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope ）。Nomarski 微分干涉差顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像。與傳統(tǒng)相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)，產(chǎn)生類似于浮雕的效果。

微分干涉差顯微鏡技術(shù)設(shè)計(jì)比相差顯微鏡要復(fù)雜得多，Nomarski DIC 利用的是偏振光，具有四個特殊的光學(xué)組件：偏振器（polarizer ）、DIC 棱鏡、DIC 滑行器和檢偏器（analyzer ）。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了二個楔形單軸的晶體 , 如石英, 以光軸互相交錯的方式互相接合，稱為Wollaston 棱鏡或Nomarski 棱鏡，即DIC 棱鏡。此棱鏡可將每一光線分離成為二條偏振互相垂直的兩束光（x 和y ），二者成一小夾角，聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。*初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了**個 Wollaston 棱鏡，即DIC 滑行器，它把兩束光波合并成一束，這時(shí)兩束光的偏振面（x 和y ）仍然存在。*后光束穿過**個偏振裝置，即檢偏器，在光束形成目鏡DIC 影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角，檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。 x 和y 波的光程差決定著透光的多少，當(dāng)光程差值為0 時(shí)，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時(shí)，穿過的光達(dá)到*大值，于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)便呈現(xiàn)出亮暗差。為了使影像的反差達(dá)到*佳狀態(tài)，觀察者可通過調(diào)節(jié) DIC 滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，改變光程差可以改變影像的亮度。而調(diào)節(jié)DIC 滑行器則可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，產(chǎn)生了類似大理石上的浮雕感覺。 DIC 顯微鏡使細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，因此適合應(yīng)用于顯微操作技術(shù)。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常需要在這種顯微鏡下進(jìn)行。

  雖然 Nomarski 微分干涉技術(shù)可以對付一些細(xì)胞團(tuán)或者組織等較厚的樣品，但它非常昂貴，并且僅僅只能應(yīng)用在玻璃底的培養(yǎng)皿中，無法直接在廣為研究人員進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作的一般塑料材質(zhì)的培養(yǎng)皿產(chǎn)生浮雕效果，此外這種技術(shù)對于顯微操作技術(shù)的所使用的樣品而言，景深還是稍嫌不足，因此在應(yīng)用上遇到不少問題。有鑒于此，一些其它的可以用于觀察厚樣品的微分干涉技術(shù)也逐漸被開發(fā)出來。例如 OLYMPUS 奧林巴斯公司就推出了自己的浮雕相襯（ RC ）裝置奧林巴斯浮雕相襯系統(tǒng)能夠產(chǎn)生高反差的 3D 圖像，類似于 DIC 效果，可用于塑料器皿中的樣品。浮雕相襯用于細(xì)胞受精，使細(xì)胞核膜更容易看到和穿刺。適用于所有類型的細(xì)胞 , 組織 ( 無論活體 , 染色 , 未染色 ), 晶體表面細(xì)節(jié) , 透明聚合物 , 玻璃和其它類似材料 , 尤其適應(yīng)于顯微操作實(shí)驗(yàn)。